所谓“鬼带”，就是在跑大分子蛋白质时，泳道顶端常会出现一些未知大分子条带或加样孔底部出现沉淀。在处理这个问题之前，我们有必要了解一下“鬼带”是如何产生的？

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“鬼带” 的产生可能与 SDS-PAGE 上样前的样品处理具有密切关系，所以我们需了解 SDS-PAGE 上样前的样品处理过程，通常在 SDS-PAGE 上样之前会使用上样缓冲液（loading buffer）处理蛋白质样品，但 loading buffer 的成分具体是什么？又都分别起到什么作用呢？

知识小课堂

常用的 loading buffer 是以 Ulrich K. Laemmli 教授于 1970 年发明的 Laemmli 样品缓冲液为基础进行改良的。

——Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. nature, 227(5259), 680.）

Loading buffer 主要包含：

（1）十二烷基硫酸钠（SDS）；

（2）硫醇剂，如 β- 巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）；

（3）甘油；

（4）Tris；

（5）溴酚蓝。

（1）loading buffer 中的 SDS 可以覆盖蛋白质本身的电荷，赋予蛋白质净负电荷，同时与硫醇试剂一起使蛋白质线性化，在电泳时蛋白质的分离只与蛋白质分子大小有关而与形状等无关。 

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（2）loading buffer 中的甘油可以增加样品的密度，确保样品向下移动到点样孔中，防止样品飘出点样孔。

（3）loading buffer 中的 Tris 可以将缓冲体系的 pH 保持在 6.8 左右，防止在低温保存的过程中蛋白质肽键断裂，保证了蛋白质的稳定性；同时，Tris 可以抑制酶促反应并防止蛋白酶降解蛋白质。

（4）loading buffer 中的溴酚蓝在视觉上指示样品在凝胶中的位置（示踪染料），以便适时终止电泳。 

2X 浓缩 loading buffer 配方（仅参考）：4% SDS、10% β- 巯基乙醇（非还原电泳可不加）、20% 甘油、0.1 M Tris pH 6.8 和 0.005% 溴酚蓝；

浓缩的 loading buffer 可在 - 20℃下储存至少一年。

使用 loading buffer 处理蛋白质样品后还需要加热（通常 95℃左右）处理 3~5min，这样做的目的一方面可以破坏蛋白质的高级结构，使其变成线性分子；另一方面促进蛋白质和 SDS 结合，形成蛋白质 - SDS 胶束（长椭圆棒状），使蛋白质带上负电荷，便于在 SDS-PAGE 中分离。 

注：煮沸处理并非适用于所有蛋白质，有些蛋白质仅需 50~70℃加热或无需加热（多见于膜蛋白），具体情况请参照抗体试剂说明。

此外，loading buffer 处理样品对抗体孵育步骤也很重要，蛋白质的线性化可使蛋白抗原表位充分暴露，以增加蛋白抗原与特异性抗体的识别及结合能力。 

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通过以上分析，我们已经明了 loading buffer 在 SDS-PAGE 中的重要作用，我们再来分析 “鬼带” 是如何形成的？

“鬼带” 的产生主要是由于硫醇试剂在加热过程中被氧化而失去活性，致使线性化的蛋白质分子重新折叠及亚基缔合，聚合成大分子，其分子量大于目标蛋白，在 WB 中可与目标蛋白对应的抗体作用，于泳道顶端形成大分子条带；此外，有时该聚合物无法进入分离胶，则会在加样孔底部或浓缩胶中产生沉淀。

处理方法：样品加热处理后，再添加适量的 DTT 或 β- 巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或者可加入适量的 EDTA 来阻止还原剂的氧化。

总的来说，无论是电泳还是 WB 实验，上样前对蛋白质样品进行处理都非常重要，除此之外蛋白质的提取方法也很重要，不同的蛋白质提取方法会影响蛋白质样品的质量及实验的成功，在这里向大家推荐 Invent 柱式法蛋白提取技术，相比于传统裂解液方法（如 RIPA 仅可获取可溶性蛋白），Invent 柱式法蛋白提取技术具有以下优点：

（1）优化配方裂解液 —— 有效溶解蛋白包括难溶性蛋白、提高蛋白得率；

（2）特制离心柱 —— 有效去除核酸以避免核酸对下游实验的干扰；

（3）天然蛋白裂解液 / 变性裂解液 —— 满足不同实验需求； 

(A) 同质量细胞样品分别使用同体积 RIPA 强、中、弱以及 INVENT SD-001 裂解液处理，离心后 RIPA 强、中、弱裂解液处理后仍有不溶性组分，而 INVENT SD-001 有效溶解样品。

(B) 使用 INVENT SD-001 裂解液再次处理 RIPA 中、弱处理后的不溶性组分，不溶组分有效溶解。

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